多因子檢測(cè)試劑盒（Multiplex Assay Kit）磁珠讀數(shù)異常原因及解決方案
基于流式熒光法的多因子檢測(cè)技術(shù)是在不同顏色或大小的編碼微球上包被不同的特異性抗體，以達(dá)到單個(gè)樣本可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)因子，從而實(shí)現(xiàn)高通量的蛋白定量技術(shù)。云克隆公司有十多年的蛋白、抗體和ELISA試劑盒的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)采用和ELISA一致的抗體對(duì)篩選和試劑優(yōu)化體系，在此基礎(chǔ)之上開發(fā)出了更高標(biāo)準(zhǔn)和更高性能的多因子檢測(cè)試劑盒（Multiplex Assay Kit），力求為客戶提供更便利更全面的分析工具。多因子檢測(cè)試劑盒自上市以來(lái)備受科研工作者的青睞，但由于和ELISA的操作方法大有不同，大家在使用過(guò)程中可能會(huì)遇到各種操作方面的問(wèn)題，尤其是樣本磁珠讀數(shù)異常的問(wèn)題較為常見。本期我們整理出可能原因和處理建議供大家參考：
1. 樣本中的脂質(zhì)、膠體或沉淀物等導(dǎo)致磁珠聚集和沉淀：
1）所有樣本在使用前建議再次4℃離心20-30分鐘，轉(zhuǎn)速10,000×g。離心后取上清進(jìn)行檢測(cè)。冷凍樣本建議解凍后按照上述方法再次離心后取上清檢測(cè)。再次離心的原因是為了除去可能存在的任何碎片、脂質(zhì)和細(xì)胞等雜質(zhì)。這些雜質(zhì)可能會(huì)在樣本和磁珠孵育的過(guò)程中造成磁珠聚集和沉淀，從而影響最終的磁珠讀數(shù)。尤其是針對(duì)血漿樣本，細(xì)胞或組織裂解液或其他有粘性或者明顯含有脂質(zhì)、碎片的樣本類型；
2）對(duì)于某些粘性物質(zhì)含量較大或顆粒物含量較多的樣本，可能需要重復(fù)離心2~3次才能獲得完全澄清的上清液，這對(duì)多因子檢測(cè)至關(guān)重要；
3）樣本和磁珠一起孵育的過(guò)程中需保證充分振蕩，避免磁珠因振蕩不足結(jié)塊，導(dǎo)致洗板不充分或者讀數(shù)時(shí)無(wú)法獲取足夠的磁珠；
4）組織勻漿類樣本和磁珠反應(yīng)時(shí)，建議覆膜室溫（18-25℃）避光振蕩反應(yīng)2h或者4℃過(guò)夜，效果會(huì)優(yōu)于37℃避光振蕩1.5h。4℃震蕩孵育過(guò)夜后需先在室溫下振蕩1h之后再進(jìn)行后續(xù)步驟，以避免孵育時(shí)間太久和低溫導(dǎo)致的磁珠凝結(jié)；
5）溶血樣本中的細(xì)胞碎片等其它雜質(zhì)太多會(huì)導(dǎo)致磁珠凝結(jié)，另外，紅細(xì)胞裂解釋放的血紅蛋白等物質(zhì)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，溶血樣本不建議進(jìn)行檢測(cè)。
2. 磁珠保存不當(dāng)造成讀數(shù)異常：
磁珠需4℃避光保存，不可置于-20℃冷凍保存或室溫保存，低溫和長(zhǎng)期室溫會(huì)影響磁珠的性能，導(dǎo)致結(jié)合效率降低，影響檢測(cè)結(jié)果。
3. 磁珠在加入板孔前沒(méi)有完全懸浮，導(dǎo)致加入板孔中的磁珠數(shù)不足或磁珠在板孔間的均一性較差影響最終檢測(cè)結(jié)果：
預(yù)混合磁珠使用前，請(qǐng)用渦旋混合儀輕柔震蕩防止磁珠沉降。加入板孔中時(shí)請(qǐng)保持預(yù)混磁珠處于懸浮狀態(tài)。檢測(cè)過(guò)程中預(yù)混合磁珠需避光。
4. 洗板過(guò)程中由于洗板操作不當(dāng)造成的磁珠丟失：
1）請(qǐng)使用合適的磁力架，需保證96孔板牢固吸附在磁力架底部，洗板過(guò)程中請(qǐng)保持96孔板在磁力架上。建議手動(dòng)洗板，即用單通道或多通道移液器小心將板孔內(nèi)液體移除，殘留在板孔內(nèi)的少量液體無(wú)需吸干，更不要在紙上拍打酶標(biāo)板；
2）若使用自動(dòng)洗板機(jī)進(jìn)行洗板，請(qǐng)調(diào)整好吸液針和96孔板之間的高度，以防吸液針觸及板孔底部將磁珠吸出。請(qǐng)?jiān)谑炀毷褂米詣?dòng)洗板機(jī)之后再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。
5. 讀數(shù)之前沒(méi)有充分懸浮板孔中的磁珠，導(dǎo)致進(jìn)樣針堵塞或吸取的磁珠不足：
每次使用前請(qǐng)充分清潔進(jìn)樣針，調(diào)整好進(jìn)樣針和板孔之間的高度。同時(shí)，在讀數(shù)前請(qǐng)充分振蕩96孔板，使板孔中的磁珠懸浮，可借助渦旋振蕩儀振蕩或者移液器反復(fù)吹打使磁珠充分懸浮，必要時(shí)也可進(jìn)行超聲處理使磁珠分散。
6. 儀器使用或設(shè)置不當(dāng)造成磁珠讀數(shù)異常：
儀器在使用之前需進(jìn)行校準(zhǔn)和驗(yàn)證。針對(duì)不同的儀器需要調(diào)整進(jìn)樣針的高度，如有必要可向廠家咨詢儀器設(shè)置參數(shù)。
云克隆多因子試劑盒操作視頻詳見:
多因子檢測(cè)試劑盒（Multiplex Assay Kit）磁珠讀數(shù)異常原因及解決方案
多因子試劑盒常見問(wèn)題原因及解決方案總結(jié)：
問(wèn)題 | 可能原因 | 解決方案 |
| 標(biāo)準(zhǔn)曲線差 | 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備不正確 | 進(jìn)行正確的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋 |
吸取及洗滌不充分 | 充分的吸取及洗滌 | |
移液不精確 | 檢查和校正移液器 | |
精密度低 | 磁珠洗滌不充分 | 按說(shuō)明書要求充分震蕩洗滌和浸泡 |
混勻不充分和吸取試劑不足 | 充分混勻和吸取試劑 | |
重復(fù)利用吸頭、容器和覆膜 | 使用加樣器要更換新的吸頭、使用新的容器和覆膜 | |
加樣不精確 | 檢查和校正移液器 | |
MFI值低 | 每孔加的試劑量不精確 | 校正移液器，精確加入試劑 |
溫育時(shí)間不正確 | 保證充足的溫育時(shí)間 | |
溫育溫度不正確 | 試劑要平衡至室溫并保證準(zhǔn)確的溫育溫度 | |
磁珠丟失 | 確保洗板過(guò)程保持在磁力架上，不要在吸水紙上拍打 | |
PE標(biāo)記物失效 | 更換試劑 | |
PE標(biāo)記物稀釋倍數(shù)不對(duì) | 按照說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)操作 | |
超出讀數(shù)時(shí)間讀數(shù) | 在說(shuō)明書推薦的讀數(shù)時(shí)間內(nèi)讀數(shù) | |
樣本值異常 | 不正確的樣本儲(chǔ)存方式 | 正確儲(chǔ)存樣本，使用新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn) |
PE標(biāo)記物稀釋倍數(shù)不對(duì) | 按照說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)操作 | |
超出讀數(shù)時(shí)間讀數(shù) | 在說(shuō)明書推薦的讀數(shù)時(shí)間內(nèi)讀數(shù) | |
不正確的樣本儲(chǔ)存方式 | 正確儲(chǔ)存樣本，使用新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn) | |
樣本收集和處理方法不正確 | 采取正確的樣本收集和處理方法 | |
待測(cè)物在樣本中的含量低 | 使用新鮮樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn) | |
磁珠數(shù)量 不足 | 樣本中的脂質(zhì)、膠體或沉淀物導(dǎo)致珠粒聚集和沉淀 | 使用前去除脂質(zhì)、膠體、沉淀物等，重新離心樣品后取上清液檢測(cè) |
磁珠在加入板孔前沒(méi)有完全懸浮 | 使用前用渦旋混合儀輕柔震蕩預(yù)混合磁珠使其充分懸浮 | |
洗滌過(guò)程中磁珠丟失 | 使用單通道或 者多通道移液槍在距離磁珠遠(yuǎn)處吸除緩沖液，或者保持磁力的狀態(tài)下連同磁力架一起翻轉(zhuǎn)倒出液體 | |
讀數(shù)前磁珠未完全重懸 | 使用渦旋混合儀或者移液器吹打使磁珠完全懸浮 | |
儀器進(jìn)樣針堵塞 | 清潔進(jìn)樣針或者調(diào)整進(jìn)樣針的高度至合適的位置，必要時(shí)可對(duì)進(jìn)樣針進(jìn)行超聲檢測(cè) |
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