蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理檢測(cè)復(fù)雜樣本 中的某種蛋白的方法。將混合抗原樣本在凝膠板上進(jìn)行單向或雙向電泳，經(jīng)過 PAGE 分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白 質(zhì)，且能保持電泳分離的類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽 作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與或標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯 色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)廣泛應(yīng) 用于鑒定蛋白以及對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

蛋白質(zhì)印跡分為蛋白質(zhì)分離、蛋白質(zhì)印跡和蛋白質(zhì)鑒定三個(gè)步驟。每個(gè)步驟和 環(huán)節(jié)都可能影響到最終結(jié)果, 要想獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)步驟都不能馬虎?，F(xiàn) 就實(shí)驗(yàn)中遇到的常見問題進(jìn)行分析總結(jié)，給出解決方案，以提高蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的 成功率。

1.蛋白質(zhì)分離-電泳中的問題

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)是建立在聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE 基礎(chǔ)上的，所以蛋 白質(zhì)印跡有些問題是由前期電泳引起的。因此，在此簡(jiǎn)單介紹電泳中出現(xiàn)的問題。

出現(xiàn)的問題	可能的原液	處理方法	圖例
A. “ 微笑”（） 形帶	凝膠濃度過高； 凝膠中部凝固不均勻，多 出現(xiàn)于較厚的凝膠中； 電泳系統(tǒng)溫度偏高	選擇合適濃度的凝膠； 待凝膠充分凝固后再做實(shí) 驗(yàn)； 水浴降溫電泳。
B.“皺眉”（）形 帶	裝置不合適，特別可能是 凝膠和玻璃擋板底部有 氣泡。	可在兩板間加入適量緩沖 液，以排除氣泡
C 拖尾	樣品融解效果不佳 分離膠濃度過大引起的	加樣前離心； 選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液， 加適量樣品促溶劑； 重新配制電泳緩沖液； 降低凝膠濃度；
D 紋理	樣品不溶性顆粒引起的	加樣前離心； 加適量樣品促溶劑；
E 條帶偏斜	電極不平衡或者加樣位 置偏斜	檢查電極是否接觸良好； 拔梳子的時(shí)候動(dòng)作輕柔， 保證加樣孔的平坦；
F 條帶向兩邊擴(kuò) 散	加樣量過多	樣本在上樣前先進(jìn)行蛋白 定量，根據(jù)具體濃度選擇 合適的上樣量；

2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印-轉(zhuǎn)膜中的問題

轉(zhuǎn)膜是蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的一步。轉(zhuǎn)膜不完全和轉(zhuǎn)膜過度都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜效 率低，而導(dǎo)致在檢測(cè)鑒定是出現(xiàn)信號(hào)弱或無信號(hào)的情況出現(xiàn)。優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件可有效 提高轉(zhuǎn)膜效率。

表2. 轉(zhuǎn)膜中的問題及解決方法